In vitro and in vivo evaluation of sodium dodecyl sulfate (SDS) as an inactivator of caprine lentivirus (CLV) in colostrum and milk / Avaliação in vitro e in vivo do dodecil sulfato de sódio (SDS) como inativador do lentivírus caprino (LVC) em colostro e leite

The aim of this study was to evaluate in vitro and in vivo the effect of sodium dodecyl sulfate (SDS) on the caprine lentivirus (CLV) in colostrum and milk. This was performed to develop a practical and efficient method of blocking the lactogenic transmission of the virus. In the in vitro experiment, colostrum and milk were treated with 0.25%; 0.50% and 1% SDS. Then, somatic cells of colostrum and milk were submitted to co-culture with caprine synovial membrane cells (CSM). In the in vivo test, goats were fed with colostrum and milk provided from CLV-positive goats treated with SDS in the same concentrations used in the in vitro experiment. Animals were tested by nested polymerase chain reaction (nPCR) and Western blot (WB) assays. In the in vitro experiment, inhibitory activity against CLV without inactivation occurred in colostrum with all SDS concentrations. However, concentrations of 0.25 and 0.5% SDS presented only inhibitory activity against CLV in milk cells, and 1% concentration provided inactivation of the virus. In the in vivo tests, none of the three concentrations of SDS was effective in inactivating LVC in colostrum or goat milk, which was confirmed by seroconversion and presence of proviral DNA in animals afterwards.(AU)

O objetivo da pesquisa foi avaliar in vitro e in vivo o efeito do dodecil sulfato de sódio (SDS) sobre o lentivírus caprino (LVC) no colostro e no leite, a fim de desenvolver um método prático e eficiente no bloqueio da via de transmissão lactogênica do vírus. No experimento in vitro, o colostro e o leite de cabras positivas foram tratados com SDS a 0,25%, 0,50% e 1,0%. Em seguida, as células somáticas do colostro e do leite foram obtidas e direcionadas ao cocultivo com células de membrana sinovial caprina (MSC). No teste in vivo, os cabritos foram alimentados com colostro e leite providos de cabras positivas para LVC, tratados com SDS nas mesmas concentrações usadas no teste in vitro. Os animais foram acompanhados pelos testes de reação em cadeia da polimerase nested (nPCR) e western blot (WB). Nos resultados in vitro, no colostro, observou-se que, em todas as concentrações de SDS, ocorreu uma atividade inibitória contra o LVC, sem a inativação. Em relação às células do leite, o SDS apresentou, nas concentrações de 0,25 e 0,5%, atividade inibitória contra o LVC, e na concentração de 1%, houve inativação viral. Nos testes in vivo, as três concentrações de SDS testadas não foram efetivas na inativação do LVC no colostro e no leite caprino, o que se comprovou pela soroconversão e pela presença de DNA proviral nos animais.(AU)

Transmission of caprine arthritis encephalitis virus between sheep / Transmissão do vírus da artrite encefalite caprina entre ovinos

ABSTRACT: This study was conducted to evaluate caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) transmission among sheep using 15 lambs that were distributed in 2 experimental groups. The exposed group consisted of 10 lambs that remained with their mothers, who were experimentally infected with CAEV. The non-exposed group was characterized as the control group and was comprised of 5 lambs that remained with their CAEV-negative mothers. Blood samples were collected monthly from birth until 1 year of life. To evaluate the transmission, an agar gel immunodiffusion test (AGID), enzyme immunoassay (ELISA), immunoblotting (IB), and nested polymerase chain reaction (nPCR) techniques were used. The non-exposed group was negative in all of the tests throughout the whole experiment. In the exposed group, 2 individuals had positive nPCR results. Positive nPCR samples were sequenced for comparison with the original goat strains and were shown to be similar to the CAEV-Cork strain. Seroconversion was not detected, and clinical manifestations were not observed. Thus, after 1 year of observation, it was verified that CAEV transmission among sheep is possible; however, with discreet frequency. This was an initial study, and other experiments are needed to analyze the adaptive capacity of the CAEV to remain in an infected sheep flock and cause the disease.

RESUMO: O estudo foi conduzido para avaliar a transmissão do vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) entre ovinos, utilizando 15 cordeiros, distribuídos em dois grupos experimentais. O grupo exposto foi constituído por 10 cordeiros, mantidos com suas mães, que foram infectadas, experimentalmente, com CAEV. O grupo não exposto caracterizou-se como grupo controle e foi formado por cinco cordeiros, mantidos com suas matrizes, negativas para CAEV. Foram colhidas amostras de sangue mensalmente, do periodo que compreende o nascimento até um ano de vida. Para avaliar a transmissão, foram utilizadas as técnicas de imunodifusão em gel de agarose (IDGA), ensaio imunoenzimático (ELISA), immunoblotting (IB) e reação em cadeia da polimerase do tipo nested (nPCR). O grupo não exposto se manteve negativo aos testes durante todo o experimento. Já no grupo exposto, dois indivíduos apresentaram resultados positivos na nPCR. As amostras positivas na nPCR foram sequenciadas para serem comparadas com as cepas originais de caprinos, comprovando se tratar de lentivírus semelhante à cepa CAEV-Cork. A soroconversão não foi detectada e a manifestação clínica não foi observada. Sendo assim, após um ano de observação, verificou-se que a transmissão do CAEV entre ovinos é possível, entretanto, com discreta frequência. Este foi um estudo inicial, e outros experimentos são necessários para analisar a capacidade adaptativa do CAEV de permanecer em rebanho ovino infectado e, com isso, causar doença.

Caprine lentivirus in sheep milk and semen / Lentivírus caprino em leite e sêmen de ovinos

With the objective of detecting the presence of caprine lentivirus (CLV) in ewe milk and in ram semen, ten matrixes and four reproducers experimentally infected with CLV were used. Samples of ewe milk were collected during the four months of lactation, five collections per animal, totaling 50 samples. Regarding the rams, eight semen collections were made per animal, during one year of experimentation, totaling 32 samples. The milk and semen samples were submitted to DNA extraction and the nested polymerase chain reaction test (nPCR) to detect CLV proviral DNA. Eight (16%) of the milk samples were positive in nPCR originating from two ewes. Only one (3.12%) semen sample was positive. The amplification products were sequenced, and were confirmed to be a CLV genomic sequence. Thus, the presence of CLV proviral DNA in sheep milk and semen was demonstrated, confirming the feasibility of infection between species, and alerting to the risk of spreading infections.(AU)

Com o objetivo de detectar a presença do lentivírus caprino (LVC) no leite de ovelhas e no sêmen de carneiros, utilizaram-se 10 matrizes e quatro reprodutores infectados experimentalmente com o LVC. Foram coletadas amostras de leite das ovelhas durante os quatro meses de lactação, ocorrendo cinco coletas por animal, totalizando 50 amostras. Quanto aos carneiros, realizaram-se oito coletas de sêmen por animal, durante um ano de experimentação, totalizando 32 amostras. As amostras de leite e de sêmen foram submetidas à extração de DNA e à prova de reação em cadeia da polimerase do tipo nested (nPCR) visando à detecção de DNA proviral do LVC. Oito (16%) amostras de leite foram positivas na nPCR oriundas de duas ovelhas. Apenas uma (3,12%) amostra de sêmen apresentou positividade. Produtos da amplificação foram sequenciados, confirmando-se tratar de sequência genômica do LVC. Dessa forma, demonstrou-se a presença do DNA proviral do LVC em leite e sêmen de ovinos, confirmando a viabilidade da infecção entre espécies e, assim, alertando sobre o risco de que a infecção seja disseminada.(AU)

Small ruminant lentiviruses: economic and productive losses, consequences of the disease / Lentiviroses de pequenos ruminantes: perdas produtivas e econômicas, consequências da doença

Small ruminant lentiviruses, caprine arthritis encephalitis virus, and Maedi-Visna virus cause diseases that result in significant productive losses, mostly in dairy animals. These viruses belong to the Retroviridae family, Lentivirus genus, and constitute a heterogeneous group, which may generate implications for the diagnosis and control of small ruminant lentiviruses. Losses caused by them are associated with reproductive failure, short productive life, and decreased milk production by the infected animals. In addition, these viruses may reduce milk quality, affecting the production of dairy products such as cheese. Small ruminant lentiviruses lead to indirect losses, decreasing herd value and forcing the development of epidemiological trade barriers for animal germplasm. Control of small ruminant lentiviruses is important to promote optimal milk production and to reduce costs with medicine and technical assistance. This control may vary in caprine and ovine populations of each country, according to seroprevalence, variety of breeds, and peculiarities of the practiced management.(AU)

Os lentivírus de pequenos ruminantes, o vírus da artrite encefalite caprina e o vírus Maedi-Visna causam enfermidades que ocasionam perdas produtivas significativas, principalmente em animais com aptidão leiteira. Esses vírus pertencem à família Retroviridae e ao gênero Lentivirus e formam um grupo genético heterogêneo, o que pode ocasionar implicações para o diagnóstico e o controle dos lentivírus de pequenos ruminantes. As perdas causadas pelos lentivírus de pequenos ruminantes estão relacionadas com falhas reprodutivas, vida produtiva curta e diminuição da produção leiteira dos animais infectados. Além disso, esses vírus podem promover a redução da qualidade do leite, afetando a produção de laticínios, tal como o queijo. Os lentivírus de pequenos ruminantes levam a perdas indiretas, reduzindo o valor dos rebanhos e forçando o desenvolvimento de barreiras comerciais epidemiológicas para germoplasma animal. O controle dos lentivírus de pequenos ruminantes é importante para promover uma maior produção de leite e reduzir os custos com medicamentos e assistência técnica. Esse controle pode variar de acordo com a população caprina e ovina de cada país em termos de soroprevalência, variedade de raças e particularidades do manejo adotado.(AU)

Soroprevalência da infecção por lentivírus de pequenos ruminantes em abatedouros do estado de Pernambuco, Brasil / Seroprevalence small ruminant lentiviruses in the state of Pernambuco slaughterhouses, Brazil

A soroprevalência da infecção por lentivírus de pequenos ruminantes (LVPR) foi determinada em amostras de soros sanguíneos de caprinos e ovinos de aptidão cárnea provenientes de abatedouros de dez municípios do estado de Pernambuco, Brasil. O diagnóstico sorológico ocorreu por meio da imunodifusão em gel de agarose (micro-IDGA) com antígenos dos vírus artrite encefalite caprina (CAE)/Maedi-Visna. Entre as 369 amostras de caprinos, 7(1,89%) (0,8-3,9%) eram soropositivas, e, entre as 383 de ovinos, 1 (0,26%) (0,0-1,4%) estava infectada. Os 7 caprinos soropositivos procederam dos abatedouros públicos dos municípios de Gravatá (n=2), Sertânia (n=4) e Timbaúba (n=1), e o ovino soropositivo veio do abatedouro público de Serra Talhada. A soroprevalência da infecção por LVPR em pequenos ruminantes oriundos de abatedouros do estado de Pernambuco, de 1,06% (8/752), é considerada baixa.(AU)

The prevalence of lentivirus infection of small ruminants (LVPR) was determined in samples of serum from goats and sheep in slaughterhouses from ten districts of Pernambuco State. The serological test was used in agarose gel immunodiffusion (AGID) with antigen caprine arthritis and encephalitis virus (CAE)/Maedi Visna virus. Among the 369 blood serum samples of goats examined, seven (1.89%) (0.8-3.9%) were seropositive, and among the 383 sheep samples examined, just one (0.26%) (0.0-1.4%) was infected. The seven seropositive goats came from public slaughterhouses from Gravatá (n=2), Sertânia (n=4) and Timbaúba (n=1), and the soropositive sheep was from a public slaughterhouse of Serra Talhada. The soroprevalence of LVPR infection in small ruminants from Pernambuco's slaughterhouses, of 1.06% (8/752), is considered low.(AU)

Construction and identification of CCDC67 gene lentiviral vector / 中华内分泌外科杂志

Objective To construct a]entiviral expression vector carrying CCDC67 and to obtain CCDC67 efficient and stable expression in mammalian cells.Methods The DNA fragment of CCDC67 coding sequence was amplified by PCR with designed primer from the cDNA library including CCDC67 gene,and then subcloned into GV208 vector with in-fusion technique to generate the lentiviral expression vector,GV208-CCDC67.The positive clones were screened by PCR and the correct CCDC67 was confirmed by sequencing.Recombinant lentiviruses were produced in 293T cells after the cotransfection of GV208-CCDC67,and packaging plasmids of pHelper 1.0 and pHelper 2.0 Green fluorescent protein (GFP)expression in 293T cells was observed to evaluate gene delivery efficiency.CCDC67 protein expression in 293T cells was detected by Western blot.Resuits The lentiviral expression vector carrying CCDC67 was successfully constructed and CCDC67 protein expression was detected in 293T cells.Conclusion The recombinant lentivirus GV208-GFP-CCDC67 is successfully constructed and it lays a foundation for further molecular function study of CCDC67.

Ferramentas diagnósticas de Lentivirose de Pequenos Ruminantes: padronização da técnica de ELISA indireto / Diagnostic tools of small ruminant lentiviruses: standardization of indirect ELISA

As Lentiviroses de Pequenos Ruminantes (LVPR) incluem a Maedi-Visna (MV) em ovinos e a Artrite Encefalite Caprina (CAE). Essas enfermidades estão difundidas no mundo e são responsáveis por grandes perdas na produtividade destes animais. Os LVPR são vírus RNA da subfamília Lentivirinae que causam uma infecção persistente, sendo a detecção precoce uma das formas mais eficientes para limitar sua disseminação no rebanho. Visando contribuir com essas questões, este experimento foi realizado na Universidade Federal do Piauí (UFPI) em parceria com a Embrapa Caprinos e Ovinos, com o objetivo de padronizar a técnica de ensaio imunoenzimático indireto e compará-lo com a imunodifusão em gel de agarose no diagnóstico da CAE. Foram utilizadas 696 amostras de soros de caprinos machos e fêmeas oriundas do banco de soros da Unidade de Pesquisa de LVPR do Centro de Ciências Agrárias da UFPI. As amostras foram coletadas no período de janeiro de 2007 a março de 2010. Na padronização, verificou-se que 0,25 µg de proteína/poço, diluição de 1:200 do soro e concentração de 1:3.000 do conjugado anticorpo anti-IgG cabra apresentaram os melhores resultados. O ponto de corte obtido foi de 0,36. Na comparação, o Imunodifusão em Gel de Ágar (IDGA) detectou 128 (18,4%) amostras positivas, e o ELISA indireto (ELISA-i), 259 (37,2%). A sensibilidade e a especificidade do teste ELISA-i com relação ao IDGA foi de 94,5% e 75,7%, respectivamente. Verificou-se maior índice de positividade em caprinos acima de seis meses (p < 0,05), e nos machos obteve-se prevalência de 56,7% em comparação às fêmeas, 35,4%, (p < 0,01).(AU)

The Small Ruminant Lentiviruses (SRLVs) include Maedi-Visna (MV) of sheep and Caprine Arthritis-Encephalitis (CAE). These diseases are widespread and responsible for major production losses regarding sheep and goats. The SRLV is a RNA virus of the subfamily Lentivirus genus that causes persistent infections in goats. Early detection is one of the best ways to limit its spread in the herd. To contribute to these issues, this experiment was conducted at Universidade Federal do Piauí in partnership with Embrapa Goats and Sheep, with the objective of standardizing the technique of indirect ELISA (i-ELISA) and to compare it with Immunodiffusion in Agarose Gel to diagnose Caprine Lentiviruses (LC). Six hundred ninety six serum samples were used from the University Veterinary Hospital, Universidade Federal do Piauí, from January 2007 to March 2010. Standardization showed that 0.25 µg protein/well, a 1:200 dilution of the serum and concentration of 1:3,000 of the conjugated anti-goat IgG presented the best results. It was observed that the Agar Gel Immunodiffusion (AGID) detected 128 (18.4%) positive samples, and ELISA, 259 (37.2%). The sensitivity and specificity of i-ELISA regarding AGID were 94.5% and 75.7%, respectively. A higher prevalence was observed among animals older than six months (p < 0.05). The prevalence among males was of 56.7%, and among females, 35.4% (p < 0.01).(AU)

Forma nervosa da artrite-encefalite caprina / Nervous form of caprine arthritis-encephalitis

São descritos dois casos de caprinos, fêmeas, mestiços da raça Saanen de dois meses de idade com sinais clínicos de paresia de membros posteriores, incoordenação, dificuldade respiratória e caquexia, que foram submetidos à eutanásia, devido ao prognóstico desfavorável. Na necropsia, observou-se congestão do sistema nervoso central (SNC) e consolidação pulmonar nos dois caprinos. Microscopicamente, as alterações foram caracterizadas por leucoencefalomielite linfoplasmocítica multifocal, com vacuolização do neurópilo e esferoides axonais, leptomeningite, pneumonia intersticial não supurativa no caprino A e broncopneumonia bacteriana no caprino B. O exame de imuno-histoquímica (IHQ) foi positivo para o vírus da artrite-encefalite caprina em fragmento de tálamo. A prova de imunodifusão em gel de ágar (IDGA) foi realizada em vinte animais do rebanho de origem e dezesseis animais foram positivos. O diagnóstico da forma nervosa da infecção pelo vírus da artrite-encefalite caprina (CAEV) foi baseado no quadro clínico-patológico, IHQ e IDGA. Esta apresentação clínica da CAE pode ser pouco comum no Brasil, mas deve ser considerada em caso de doenças neurológicas em pequenos ruminantes.

Two cases are described of female goats, Saanen crossbreds, two months old, with clinical signs of hind limb paresis, incoordination, difficulty breathing and cachexia, which were subjected to euthanasia due to unfavorable prognosis. At necropsy it was possible to observe that there was congestion of the central nervous system (CNS) and pulmonary consolidation in both goats. Microscopic changes were characterized by multifocal lymphoplasmacytic leucoencephalomielitis, with vacuolization of neuropile and axonal spheroids, leptomeningitis, interstitial nonsupurative pneumonia in goat A and bacterial bronchopneumonia in goat B. Immunohistochemistry (IHC) was positive for the caprine arthritis - encephalitis virus in thalamus fragments. The agar gel immunodiffusion (AGID) test was performed in sera sample of twenty animals and sixteen resulted positive. Diagnosis of the nervous form of caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV) infection was based on clinical and pathological status, IHC and AGID. This clinical presentation of CAE could be uncommon in Brazil, but must be considered in case of neurologic diseases in small ruminants.

Pesquisa de anticorpos contra maedi visna em ovinos nas microregiões de Botucatu, Campinas, Piedade e São Paulo, Estado de São Paulo / Survey for antibodies against maedi-visna virus in sheep in the regions of Botucatu, Campinas, São Paulo and Piedade, State of São Paulo, Brazil

O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência da infecção pelo vírus Maedi-Visna em ovinos criados nas microrregiões de Botucatu, Campinas, Piedade e São Paulo do Estado de São Paulo. As amostras de soro sanguíneo foram colhidas de 226 ovinos e foi realizada a técnica de imunodifusão em gel de ágar para a detecção de anticorpos antivírus Maedi-Visna e verificou-se que nenhuma das amostras testadas foi sororeagente. Dessa forma, faz-se necessário um estudo mais amplo no estado, a fim de se confirmar a baixa ocorrência e importância da enfermidade no estado.

Survey for antibodies against maedi-visna virus in sheep in the regions of Botucatu, Campinas, São Paulo and Piedade, state of São Paulo, Brazil. The purpose of the study was to evaluate the occurrence of infection with maedi-visna virus in sheep raised in the regions of Botucatu, Campinas, Piedade and São Paulo, state of São Paulo, Brazil, that showed symptoms of the disease. Blood serum samples collected from 226 sheep were submitted to the agar gel immunodiffusion technique for detection of antibodies against maedi-visna virus, and none of the samples tested was serum reactive. In conclusion, the maedi-visna virus has low frequency in animals raised in the regions studied.

Alterações histopatológicas da glândula mamária e qualidade do leite de cabras naturalmente infectadas com o CAEV / Histopathological changes in the mammary gland and milk quality of goats naturally infected with CAEV

Avaliou-se a influência do vírus da CAE nas características físico-químicas de amostras de leite de 54 cabras, sem predileção racial, distribuindo-as em dois grupos: cabras positivas e negativas para o teste de imunodifusão em gel de agarose. As amostras de leite foram submetidas à análise ultrassônica para obtenção de parâmetros físico-químicos - gordura, extrato seco, proteínas, lactose e densidade; realização de microbiologia - bactérias mesófilas (UCF/mL). Foram coletadas amostras de tecido mamário para exame histopatológico e imunohistoquímica. Não houve diferença significativa das características avaliadas entre os dois grupos; no microbiológico, não houve relação direta da presença de mesófilas associada à infecção pelo CAEV. Na histopatologia, observaram-se áreas com infiltração celular de monócitos, polimorfonucleares, plasmócitos, fibrose, ausência de morfologia normal do parênquima mamário, denotando processo inflamatório crônico; e foi confirmada a presença do vírus na glândula pela imunohistoquímica. Os resultados não mostraram relação direta da incidência da CAE como fator negativo no desenvolvimento do rebanho.

Aiming to evaluate the influence of CAE viruses in the chemical and physical characteristics of milk, the samples were collected from 54 goats, without racial predilection, these were divided into two groups: goats positive and negative according results of test Agarose Gel Immunodiffusion. Milk samples were ultrasonic analyzed to obtain physicochemical parameters (fat, solids, protein, lactose and density); performance microbiology (mesophilic bacteria - CFU/mL) and mammary gland samples were collected for evaluation histopathology and immunohistochemistry. The results of physical-chemical analysis showed no significant difference between the milk samples of two groups. In the microbiological analysis showed the presence of aerobic mesophilic bacteria, but this change is not associated with the presence of CAEV infection. On histopathology, there were areas with infiltration of mononuclear-leukocyte and polymorph nuclear, plasma cells, fibrosis and absence of normal morphology of the mammary tissue, indicating a chronic inflammatory process; and confirmed the presence of virus, in the gland, by immunohistochemistry. The results showed no direct relationship between incidence of CAE in the herd as a negative factor for its development, however it is known that the disease in its chronic nature, causes reduction in the productivity of the herd.